紅豆杉的組織培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)；

　　紅豆杉屬于裸子植物，主要分布于我國的云南、四川、西藏和東北，是一類具有重要開發(fā)價值的樹木，它產(chǎn)生的紫杉醇通過臨床實驗被認(rèn)為是最有希望的抗癌藥物。自然狀態(tài)下，紫杉醇的含量極低，僅占樹皮干重的十萬分之一，靠自然資源解決這一問題十分困難。同時由于自然狀態(tài)下紅豆杉生長速度很慢，過量的人工采伐，使野生資源受到了極大的破壞，在一些產(chǎn)地已面臨滅頂之災(zāi)，保護(hù)其野生資源和擴(kuò)大藥源已成為當(dāng)前急需解決的矛盾。用播種育苗和扦插繁殖雖可在一定程度上緩解矛盾，但仍無法滿足需求，也不能從根本上解決問題。利用植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)的方法來解決資源和藥源的矛盾，已成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的問題。

　　（一）材料

　　較為適宜的組培外植體為新生的嫩枝，取材時間以每年的7、8月份為宜。

　　（二）培養(yǎng)程序

　　1、愈傷組織誘導(dǎo)用培養(yǎng)基

　　培養(yǎng)基的基本成分采用B5或MS的微量元素、有機(jī)物和鐵鹽，外加KNO3 2500mg/L,NH4NO3 825mg/L KH2PO4 、240mg/L,MgSO4?7H2O 370mg/L,CaCl2?2H2O660mg/L。添加的激素種類及數(shù)量為NAA 0.8-1.0mg/L、 BA0.3-0.5mg/L，調(diào)PH值為5.8-6.0；瓊脂粉和蔗糖用量分別為5.6-6.0g/L和30g/L。配置好的培養(yǎng)基用培養(yǎng)瓶分裝，經(jīng)高溫、高壓滅菌后備用。

　　2、材料消毒與接種

　　取新生的嫩枝（帶有針葉）放入加有0.02%洗潔精的自來水中浸泡10分鐘，浸泡過程中需經(jīng)常攪動，浸泡結(jié)束后用自來水沖洗10分鐘以上。將嫩枝轉(zhuǎn)入一干凈的三角瓶中。

　　以下所有操作必須在超凈工作臺上進(jìn)行無菌操作。首先往三角瓶中加入75%的酒精，加入量應(yīng)為嫩枝體積的10倍以上，浸泡殺菌30-60秒，倒掉酒精，用無菌蒸餾水年漂洗一次；再將嫩枝轉(zhuǎn)入事先已高壓消毒的三角瓶中，加入15倍與嫩枝體積的0.1%的升汞溶液，浸泡殺菌5-8分鐘，浸泡過程中要不斷搖動，以使升汞與嫩枝充分接觸。為了達(dá)到徹底殺菌的效果，有人建議在升汞溶液中加入0.02%的表面活性劑，這樣可能更好一些，但要相對縮短殺菌時間。倒掉升汞溶液，用無菌蒸餾水沖洗4-6次，每次1-2分鐘，以徹底除去升汞。將嫩枝從三角瓶中分批取出，用無菌濾紙吸去材料表面的水分，將嫩枝切成 0.5-0.8CM的小段，并切取部分針葉，嫩枝切段和針葉同時用作外植體，接種在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上。接種時要讓針葉的腹面接觸培養(yǎng)基，嫩枝的植物學(xué)近地端接觸培養(yǎng)基。

　　注意用過的升汞溶液和沖洗液不要到處亂倒，以防重金屬污染。

　　將接種好的培養(yǎng)物放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度1500-2000lx，光照時間10h/d。

　　3、愈傷組織誘導(dǎo)

　　紅豆杉嫩枝和針葉在培養(yǎng)基上2-3周后即開始形成愈傷組織，約4-5周愈傷組織直徑可達(dá)1-2CM。不同種的紅豆杉和不同的外植體之間形成愈傷組織的比率、時間早晚和生長速度存在明顯差異，南方紅豆杉和東北紅豆杉的嫩枝切段出愈較快，出愈率分別為89%和70%，針葉出愈較慢，出愈率也較低，分別為 36%和15%；普通紅豆杉出愈較慢但出愈率較高，嫩枝和針葉的出愈率分別為94%和30%。愈傷組織開始時為灰白色，隨著愈傷組織的增大，先期形成的愈傷組織顏色由灰白色變?yōu)樽厣?，這可能預(yù)示著愈傷組織在逐漸發(fā)生褐變，因此要及時給予注意，盡量保持較低的培養(yǎng)溫度和經(jīng)常更換培養(yǎng)基。當(dāng)愈傷組織生長到一定大小時即可轉(zhuǎn)入液體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

　　4、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與繼代

　　利用愈傷組織而不是用小苗或大樹來生產(chǎn)提取紫杉醇，是一條正在探索的途徑，如果成功則可以實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，從根本上解決紅豆杉資源不足的矛盾。

　　因此，通過嫩枝和針葉培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織不需要進(jìn)行芽分化的誘導(dǎo)，而是將愈傷組織直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。具體做法是將從嫩枝和針葉上產(chǎn)生的愈傷組織取下來直接轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行（懸?。┱袷幣囵B(yǎng)，所用培養(yǎng)基與上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。在初次將愈傷轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基即可適當(dāng)加入少量纖維素酶和果膠酶，以加快愈傷組織分離成單個細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)。

　　在初次懸浮培養(yǎng)階段可用50ml的小三角瓶，每瓶加10ml液體培養(yǎng)基，放入愈傷組織，在20-23℃的搖床上振蕩培養(yǎng)，光照條件與普通培養(yǎng)相同。每周需要更換一次培養(yǎng)基，更換時用5-10ml的平頭移液管將三角瓶中的愈傷組織、單個細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)過濾出來，直接轉(zhuǎn)到新鮮的培養(yǎng)基中即可。

　　在懸浮培養(yǎng)過程中應(yīng)隨時注意每一瓶中愈傷組織、細(xì)胞團(tuán)生長的情況，挑選生長速度最快和特征最好的作為繼代的材料，毫不可惜的丟掉那些不好的（生長緩慢、顏色不正等）材料，這樣經(jīng)過幾代的選擇，就可以挑出符合理想的材料，作為懸浮系進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

　　（三）紫杉醇含量的檢測

　　現(xiàn)行的比較普遍有效的方法是利用薄層層析法，其大體過程是先將愈傷組織干燥，再用甲醇滲濾提取，獲得提取液，經(jīng)減壓濃縮至干，用水：CHCl3取。合并 CHCl3部分，再經(jīng)減壓濃縮獲得粗提液，經(jīng)薄層層析，收取喊紫杉醇和10-脫乙?；涂ǘ?III的部分，再進(jìn)行硅膠柱層析，分離收集相應(yīng)流分，減壓濃縮，TLC再次檢測，將含有紫杉醇的濃縮液進(jìn)行二次柱層析，鑒定結(jié)果。另外，紅豆杉愈傷組織經(jīng)過一定分離提取后，可進(jìn)行高效液相色譜層析（HPLC）分析，分析柱為4mm*250mm的C18柱，dp=10μm，分離體系為甲醇-乙腈-水（20：33：47）等速洗脫，流速為1ml/min。

　　關(guān)于紅豆杉植物組織細(xì)胞培養(yǎng)中褐化的問題是當(dāng)前存在的一個重要問題，該現(xiàn)象與普通木本植物組培中出現(xiàn)的褐變不同。普通木本植物出現(xiàn)的褐變可通過選用較小的外植體、培養(yǎng)基中加活性炭、縮短繼代轉(zhuǎn)移周期、盡量少損傷外植體等措施加以克服，且以后不再發(fā)生。但是，利用上述方法解決紅豆杉的褐化問題收效甚微，這或許是因為紫杉醇本身對細(xì)胞生長具有毒害作用，其量的積累往往對細(xì)胞的增殖起抑制作用。如何解決提高細(xì)胞內(nèi)紫杉醇的含量而又不給細(xì)胞的生長帶來很大影響，使二者相協(xié)調(diào)一致，是急需研究的課題。

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